Resumen

OBJETIVO: Reclasificar biopsias de cuello uterino con LIE-AG-NIC2 utilizando hematoxilina eosina y p16, estimar la asociación de la clasificación errada con el factor de riesgo edad y determinar el desempeño diagnóstico de p16 para definir la existencia de LIE-AG.

MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio prospectivo, de serie de casos, llevado a cabo en la Facultad de Medicina de la Universidad de Cartagena, Colombia. Se incluyeron biopsias de cuello uterino diagnosticadas durante un año con LIE-AG-NIC2. Se incluyeron casos con seguimiento (cono o histerectomía) y se excluyeron los que no tenían tejido archivado. La expresión de p16 se determinó mediante inmunohistoquímica. Los reclasificaron dos patólogos en dos grupos (≤LIE-BG/≤NIC1 y LIE-AG/≥NIC2) aplicando hematoxilina eosina y p16. Para la reclasificación con p16 se aplicaron χ² y prueba de Fisher y para hematoxilina eosina se tomó p16 como referencia. Se obtuvo la proporción de muestras reclasificadas y la OR de la relación de éstas con los grupos etarios (menos de 30 años y más o menos mayores de 30 años). 

RESULTADOS: Se incluyeron 39 casos. De los estudios de seguimiento, 10 de 39 resultaron negativos para LIE-AG/≥NIC2. Dieciocho de los 39 casos evaluados con p16 se reclasificaron en ≤LIE-BG/ ≤NIC1, de estos 10 correspondieron a menores de 30 años. 15 de los 18 casos reclasificados como LIE-AG/≥NIC2 pertenecían a pacientes ≥ 30 años (OR = 0.368, IC95%: -1.53). La concordancia interobservador para determinar resultado ≥ NIC2 con hematoxilina eosina fue pobre, y con p16 fue moderado. 

CONCLUSIONES: La evaluación de las biopsias de cuello uterino con el marcador p16, junto con hematoxilina eosina, tiene mayor reproducibilidad diagnóstica que solo utilizando hematoxilina eosina, que aumenta la concordancia interobservador y reduce el tratamiento innecesario, sobre todo en mujeres menores de 30 años.

PALABRAS CLAVE: Inmunohistoquímica; hematoxilina eosina; variación interobservador; reproducibilidad de los resultados. 

Abstract

OBJECTIVE: To reclassify cervical biopsies with LIE-AG-NIC2 using hematoxylin eosin and p16, to estimate the association of misclassification with risk factor age, and to determine the diagnostic performance of p16 in defining the existence of LIE-AG.

MATERIALS AND METHODS: Prospective, case series study carried out at the Faculty of Medicine of the University of Cartagena, Colombia. Cervical biopsies diagnosed during one year with LIE-AG-NIC2 were included. Cases with follow-up (cone or hysterectomy) were included and those without archived tissue were excluded. Expression of p16 was determined by immunohistochemistry. They were reclassified by two pathologists into two groups (≤LIE-BG/≤NIC1 and LIE-AG/≥NIC2) applying hematoxylin eosin and p16. 2 and Fisher’s test were applied for reclassification with p16 with respect to reclassification with hematoxylin eosin, taking p16 as reference. The proportion of reclassified samples and the OR of the relationship of these with the age groups (less than 30 years and more or less older than 30 years) were obtained. 

RESULTS: Thirty-nine cases were included. Of the follow-up studies, 10 of 39 were negative for LIE-AG/≥NIC2. Eighteen of the 39 cases evaluated with p16 reclassified to ≤LIE-BG/ ≤NIC1, of these 10 corresponded to those younger than 30 years. Fifteen of the 18 of the 18 of the cases reclassified as LIE-AG/≥NIC2 belonged to patients ≥ 30 years (OR = 0.368, 95%CI = 0.08-1.53). Interobserver agreement for determining outcome ≥ NIC2 with hematoxylin eosin was poor, and with p16 was moderate. 

CONCLUSIONS: Evaluation of cervical biopsies with the p16 marker along with hematoxylin eosin has greater diagnostic reproducibility than only using hematoxylin eosin, which increases interobserver agreement and reduces unnecessary treatment, especially in women younger than 30 years.

KEYWORDS: Immunohistochemistry; Hematoxylin Eosine; Observer variation; Reproducibility of Results; Colombia.

ANTECEDENTES

La terminología utilizada para describir las lesiones premalignas del cuello uterino ha cambiado a lo largo de las últimas décadas.¹ En el 2012 se decidió adoptar el modelo de dos niveles del Sistema Bethesda, denominándolas lesión intraepitelial escamosa (LIE) de bajo grado (LIE-BG) y de alto grado (LIE-AG); LIE-BG es equivalente a neoplasia intraepitelial cervical (NIC) grado 1 (NIC1), y LIE-AG equiparable a NIC2-NIC3 de la antigua clasificación.¹

El diagnóstico de lesión intraepitelial escamosa se basa en los hallazgos histopatológicos con coloración de rutina (hematoxilina eosina: HE) de la biopsia cervical, considerado el patrón de referencia para las conductas clínicas actuales.² Las pacientes con LIE-BG/NIC1 se tratan conservadoramente con observación y seguimiento, mientras que en quienes tienen LIE-AG/NIC2-3 se indica tratamiento escisional.³ Un sobrediagnóstico histopatológico o falso positivo conduce a tratamiento innecesario que puede tener una repercusión negativa en la vida reproductiva de las mujeres^3-6 e incrementar los costos ocasionados al sistema de salud.⁷

Si bien los patólogos interpretan los hallazgos morfológicos en las biopsias cervicales de una forma segura, rápida y costo-efectiva, aplicando una serie de técnicas heurísticas para apoyar su evaluación, a veces puede haber sesgo y error asociados, con repercusión significativa en el diagnóstico.^8,9 Por ello, en la interpretación de los hallazgos histológicos de la NIC se ha descrito una alta variabilidad diagnóstica interobservador e intraobservador,^10-20 sobre todo para las LIE-AG = NIC 2.²¹ 

Las habilidades para identificación y clasificación de las lesiones intraepiteliales escamosas están debidamente apoyadas por los recursos existentes pero han sido poco reconocidas las ventajas de otros recursos de apoyo diagnóstico que permiten mejorar los desenlaces, identificando y evitando los posibles sesgos asociados.^1,22 Varios estudios^23-33 han demostrado que la adición de inmunohistoquímica con el marcador p16 a la tinción hematoxilina eosina aumenta notablemente la concordancia interobservador en cuanto a presencia o ausencia de lesión, y a la gradación de dichas lesiones; además, facilita el diagnóstico diferencial entre las lesiones simuladoras³⁴ y las verdaderas LIE-AG, pues p16 tiene elevada sensibilidad para detectar ≥NIC2 (NIC2-NIC3), alta especificidad, su evaluación es fácil y reproducible, y aunque su uso rutinario no está estipulado, se ha aceptado para los casos dudosos. 

Los diagnósticos basados en p16 reducirían la frecuencia de LIE-AG/NIC2-3, sobre todo en pacientes menores de 30 años con alta prevalencia de infecciones transitorias por VPH y baja incidencia de cáncer de cuello uterino, y se reducirían los tratamientos innecesarios evitando las complicaciones en la vida reproductiva, enfocando la atención en determinar si la enfermedad precancerosa está verdaderamente presente, o si la lesión pudiera tratarse con seguridad con un enfoque conservador.^1,35,36,37

Para aportar evidencia adicional a estos planteamientos, los objetivos de este trabajo fueron: reclasificar con hematoxilina eosina y p16 biopsias de cuello uterino diagnosticadas como LIE-AG/NIC2, estimar la asociación de la clasificación errada con el factor de riesgo edad, y determinar el desempeño diagnóstico de p16 para definir la existencia de LIE-AG.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio prospectivo, de serie de casos, llevado a cabo en la Facultad de Medicina de la Universidad de Cartagena, Colombia. Criterios de inclusión: biopsias de cuello uterino diagnosticadas histológicamente como LIE-AG/NIC2 en el lapso de un año, en un laboratorio de referencia para patología cervical. Se seleccionaron los casos con estudio de seguimiento (cono o histerectomía) y excluyeron los que carecían del corte histológico o bloque de tejido archivado. Los casos completos incluidos (cortes y bloques de tejido) con primer y segundo estudio histopatológico se reevaluaron y reclasificaron en dos grupos (≤LIE-BG/≤NIC1 y LIE-AG/≥NIC2) con la aplicación de hematoxilina eosina y p16. Las evaluaciones de los cortes histológicos las hicieron dos patólogos de manera independiente, sin acceso a la historia clínica ni a los estudios de seguimiento, solo con el conocimiento del resultado previo de NIC2. 

Interpretación y reclasificación de los hallazgos histológicos con hematoxilina eosina

Al reevaluar los cortes histológicos con hematoxilina eosina se siguió la clasificación de Kumar (2015)³⁸ y los resultados se categorizaron en: LIE-BG/NIC1, LIE-AG/NIC2, LIE-AG/NIC3 y negativo para LIE. Se obtuvo la proporción de casos reclasificados en las diferentes categorías por los dos observadores.

Inmunohistoquímica, interpretación y reclasificación con el marcador p16 

Se tomaron nuevos cortes seriados a un bloque de tejido de cada caso y se procesaron con inmunohistoquímica, siguiendo las recomendaciones del fabricante, con el estuche comercial CINtec^® Histology (Roche^® Manheim, Germany) que usa un anticuerpo primario monoclonal de ratón clon E6H4^® dirigido a la proteína humana p16^INK4a. 

La tinción con p16 la evaluaron los mismos dos patólogos, sin conocimiento de los resultados de la reclasificación previa con hematoxilina eosina. Se clasificaron en: positivos para p16 y negativos para p16, según los criterios de Klaes.²⁴ Los casos positivos se dividieron según los tercios del epitelio escamoso que mostraron tinción en: 1/3 (LIE-BG/NIC1), 2/3 (LIE-AG/NIC2) y 3/3 (LIE-AG/NIC3),(Figura 1). Se categorizaron en negativos para p16: falta de tinción, tinción focal, dispersa o tenue, y patrones de tinción citoplasmáticos de tipo gota, dispersos y de células individuales. Los casos discrepantes se revisaron en conjunto para llegar a un consenso. 

Se correlacionaron los hallazgos de la reclasificación con p16 con los de los estudios de seguimiento, para evaluar el desempeño diagnóstico de este marcador para detectar LIE-AG.

Los datos se registraron en una base de datos de Microsoft Excel. Se utilizó la prueba Xhm (χ de Haenszel Mantel) asumiendo un nivel de significación del 95%. Se utilizó la prueba de χ² y la prueba exacta de Fisher para los resultados obtenidos con la clasificación a partir del marcador p16 con respecto a los resultados de la reclasificación con hematoxilina eosina; la prueba de referencia fue el marcador p16. Se obtuvieron los valores predictivos positivos y negativos (VPN), porcentajes de falsos positivos (FP) y de falsos negativos (FN) de la reclasificación con hematoxilina eosina y con p16, usando los grupos previamente definidos: ≤LIEBG/≤NIC1 y LIE-AG/≥NIC2. 

Se obtuvieron la proporción de muestras reclasificadas y la razón de momios de la relación de éstas con los grupos etarios (menos de 30 años y más de 30 años). La reproducibilidad diagnóstica se midió de forma cualitativa mediante el estadístico kappa, siguiendo los valores de referencia de Landis y Koch: 0.81 a 1.0 casi perfecto; 0.61 a 0.8 sustancial; 0.41 a 0.6 moderado; 0.21 a 0.4 razonable; 0 a 0.2 escaso, y kappa menor de 0.0 pobre.³⁹ Para todos los análisis se utilizó Microsoft Excel^® (Microsoft corporation, Redmond, USA) y se consideró estadísticamente significativo el valor de p < 0.05. 

RESULTADOS

A partir de las 156 biopsias con diagnóstico de LIE-AG-NIC2 se seleccionaron 40 casos con estudio de seguimiento (cono o histerectomía). Se excluyó un caso por ausencia del corte histológico. Al final se incluyeron 39 casos con diagnóstico de NIC2 con segundo estudio histopatológico de seguimiento, de éstos 3 correspondieron a conos; 2 a histerectomías y a biopsias de cuello uterino. Los resultados fueron: NIC1 en el 26% (n = 10), NIC2 en el 31% (n = 12), y NIC3 en el 43% (n = 17). La concordancia encontrada fue de 31% entre el diagnóstico inicial y el segundo estudio, con un kappa escaso (0.01). 

Después de la reclasificación en consenso con hematoxilina eosina por los dos evaluadores, se obtuvieron los siguientes diagnósticos: NIC1: 31% (n = 12), NIC2: 41% (n = 16), NIC3: 18% (n = 7) y negativo para LIE: 10% (n = 4); es decir que, de este consenso, el 41% (n = 16) de los casos se reclasificaron en ≤LIE-BG/≤NIC1 y el 59% (n = 23) en LIE-AG/≥NIC2. 

El consenso entre observadores para la reclasificación con el marcador p16 dio como resultado: NIC1: 16% (n = 6), NIC2: 37% (n = 14), NIC3: 16% (n = 6), y 31% (n = 12) negativos para p16. En conclusión, en este consenso el 47% (n = 18) de los casos se recategorizaron en ≤LIE-BG/≤NIC1 y el 53% (n = 20) en LIE-AG/≥NIC2. En algunos casos la reclasificación con hematoxilina eosina y con p16 por separado de cada uno de los observadores mostró resultados divergentes. Figura 2 

En relación con los grupos etarios establecidos, la distribución porcentual de los casos reclasificados con el marcador p16, en común acuerdo por ambos observadores, mostró que un alto porcentaje de las lesiones de pacientes menores de 30 años se reclasificaron a NIC1, en contraste, la mayoría de las lesiones de pacientes ≥ 30 años permaneció como LIE-AG/≥NIC2. Cuadro 1

Entre los casos reclasificados con hematoxilina eosina como negativos para LIE, que fueron p16-negativos, se encontraron biopsias con: metaplasia escamosa, hiperplasia de células basales y cervicitis. Las imágenes histológicas de algunos casos estudiados y sus reclasificaciones con hematoxilina eosina y p16 se muestran en la Figura 3. En algunos casos se confirmó el diagnóstico de NIC2, y otros se reclasificaron; sin embargo, debe resaltarse que todos estos casos se habían diagnosticado en LIE-AG y, por lo tanto, se trataron con conización. Figura 3 

En la reclasificación con hematoxilina eosina se obtuvo un valor kappa de 0.38 y de kappa de 0.53 en la reclasificación con p16, en relación con el diagnóstico de NIC2; y un valor de kappa de 0.94 para la reclasificación con p16 al comparar los reportes de los dos observadores. El estadístico kappa al comparar los resultados de los casos con el marcador p16 y los resultados del estudio de seguimiento fue de 0.02 (escaso). La concordancia interobservador fue mucho más alta en la reclasificación con el marcador p16 que en la reclasificación con hematoxilina eosina, y los tipos de discordancia encontrados con mayor frecuencia fueron para el diagnóstico de las LIE-BG. Figura 4

Los porcentajes de FP y FN, así como los valores predictivos positivos, negativos, sensibilidad y especificidad derivados de la reclasificación con hematoxilina eosina, con respecto a los resultados de los estudios de seguimiento, mostraron alto valor predictivo positivo y sensibilidad y especificidad moderadas (Cuadro 2, fila1). Estos mismos porcentajes, derivados de la reclasificación con p16 con respecto a los resultados de los estudios de seguimiento, resultaron en leve disminución de la sensibilidad (Cuadro 2, fila 2). Sin embargo, los porcentajes de sensibilidad y especificidad de la reclasificación con hematoxilina eosina, teniendo a la reclasificación con p16 como patrón de referencia, fueron mucho más altos que los descritos (Cuadro 2, fila 3). 

Los resultados de la evaluación de la prueba Xhm y el OR para reclasificación con el marcador p16, según los grupos etarios establecidos, se resumen en el Cuadro 3a. La significación estadística, los valores de χ² y de la prueba exacta de Fisher encontrados para los resultados de la reclasificación con hematoxilina eosina con respecto al marcador p16, teniendo como referencia esta última prueba, se muestran en el Cuadro 3b.

DISCUSIÓN

La falta de precisión del diagnóstico histopatológico de las lesiones intraepiteliales del cuello uterino, a partir del estudio con hematoxilina eosina, puede llevar a tratamiento excesivo en pacientes con lesiones simuladoras o LIE-BG, o a tratamiento insuficiente en pacientes con LIE-AG.^19,20 Está demostrado que los diagnósticos de NIC no son totalmente reproducibles con este método,^10-18 sobre todo en el caso de NIC2 debido a la considerable variabilidad inter e intraobservador.²¹ Está descrito que la adición de inmunohistoquímica con p16 aumenta notablemente la concordancia interobservador y mejora la sensibilidad y especificidad para la detección de las lesiones intraepiteliales producidas por VPH de alto riesgo.^23-29,40 

La proteína p16^INK4a es un inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina que participa en la regulación del ciclo celular de manera inhibitoria.⁴¹ Está demostrado que las altas concentraciones de la proteína E7 del VPH desencadenan señales de estrés oncogénico e inducen remodelación epigenética que lleva a la sobreexpresión de la proteína p16,^INK4a que puede detectarse por inmunohistoquímica.⁴² Diversos estudios demuestran que más del 99% de las NIC3 son p16-positivas; mientras solo 5 a 30% de las biopsias histológicamente negativas (LIE-BG/NIC1) lo son,^1,43 estas generalmente muestran un patrón de tinción de “tercio inferior” y, en muchos casos, en retrospectiva se demuestran pequeñas áreas con LIE-AG que no se habían detectado en las biopsias.^23,44 Además, se ha demostrado que la lectura conjunta de los cortes con tinción hematoxilina eosina y con la inmunotinción para p16 en cortes consecutivos de la misma muestra de tejido del cuello uterino mejora la precisión diagnóstica y la concordancia interobservador para el diagnóstico de NIC, sobre todo de NIC2.^23-29 

En nuestro estudio, en un alto porcentaje de los casos se obtuvo un diagnóstico diferente a NIC2 en el estudio de seguimiento; de estos, los resultados negativos para LIE-AG/≥NIC2 pueden estar relacionados con una lesión que haya sido resecada en su mayor parte o en su totalidad, o con un sobrediagnóstico en la biopsia inicial.

Al igual que otros estudios,^35,45-50 casi la mitad de nuestros casos se reclasificaron en ≤LIE-BG con p16, lo que puede derivar en repercusiones clínicas significativas en el tratamiento de las pacientes debido a que solo las LIE-AG deben recibir tratamiento quirúrgico.¹ En un estudio de biopsias de cuello uterino con NIC2 en mujeres jóvenes se reportó mayor frecuencia de ≤NIC1 en lugar de LIE-AG en el espécimen de resección.⁵¹ De igual manera, en estudios de revisión de casos diagnosticados con ≥NIC2, con seguimiento estricto de la lesión, mostraron que el 15% fueron reclasificados a NIC1 o a negativo,⁵² lo que pudo deberse a que la biopsia se orientó con los reportes de una prueba con baja especificidad, como la colposcopia,⁵³ que resultó en alta proporción de falsos positivos. 

La reproducibilidad diagnóstica de la biopsia, con respecto al estudio de seguimiento, fue escasa; la observada en la reclasificación con hematoxilina eosina sola fue pobre. Al reclasificar las muestras en conjunto (p16/HE), la reproducibilidad diagnóstica fue moderada para el diagnóstico específico de NIC2, y fue excelente en la interpretación de la gradación de la LIE (LIE-AG-p16-positivo/LIEBG-p16- negativo). Estos resultados sugieren que la evaluación de las muestras sugerentes de LIE con tinción de rutina, en conjunto con p16, aumenta la concordancia interobservador, lo que ha quedado demostrado en varios estudios.^{12,15,16,23-29}

El desempeño diagnóstico de este estudio de reclasificación con hematoxilina eosina fue mayor que el observado con el marcador p16 al compararlo con los reportes de los estudios de seguimiento. Estos valores de desempeño diagnóstico para p16 fueron menores a los publicados;^23-29 por ejemplo, por Galgano y su grupo,²³ quienes obtuvieron un rendimiento de p16 con sensibilidad del 68.9% y especificidad del 97.2%. Estas discordancias quizá se deban a que en nuestro estudio se compararon los resultados de la reclasificación con el marcador p16 con los del estudio de seguimiento. Sin embargo, al comparar el valor de la prueba de hematoxilina eosina con el de p16, teniendo a éste último como patrón de referencia, se encontró que, si bien la prueba tiene sensibilidad y especificidad considerables para discriminar LIE-AG de ≤ LIE-BG, arroja un importante porcentaje de falsos positivos, lo que puede derivar en tratamientos innecesarios en pacientes con diagnóstico basado solo en la tinción de hematoxilina eosina.

Las limitaciones de este estudio se derivan de su mismo carácter exploratorio: poca cantidad de casos y posible sesgo debido a que los dos patólogos evaluadores tenían conocimiento del diagnóstico de la biopsia inicial, situación que se minimizó al garantizar una revisión independiente, sin acceso a la historia clínica ni a los estudios de seguimiento.

CONCLUSIONES

En la evaluación de biopsias de cuello uterino el marcador p16, junto con la coloración de rutina, mejora su reproducibilidad diagnóstica, aumenta la concordancia interobservador y reduce significativamente, sobre todo en mujeres menores de 30 años, la cantidad de biopsias con sobrediagnóstico de lesión intraepitelial de alto grado, lo que evitaría llevar a cabo tratamientos innecesarios que pueden generar complicaciones en la vida reproductiva de estas pacientes. Para determinar el desempeño diagnóstico de p16 y definir la existencia de LIE-AG es necesario continuar efectuando estudios que incluyan mayor cantidad de muestras.

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